Abbiamo concluso con successo la costuzione delle librerie ed il sequenziamento dei nostri primi campioni ChiP-seq umani e murini; l'analisi bioinformatica e' in corso.

Abbiamo concluso con successo una prima serie di sequenziamenti ed analisi SAGE (su campioni sia umani che murini), ottenendo una media di 40.000.000 di tag di 26 nucleotidi per campione, di cui circa il 50% direttamente mappabile su trascritti Refseq codificanti e non codificanti. L'analisi bioinformatica e' in corso.

Nell'ambito di una collaborazione scientifica con un laboratorio dell'Istituto Pasteur di Parigi, abbiamo concluso con successo il sequenziamento e l'analisi di un trascrittoma umano intero su due campioni, ottenendo una ottima correlazione con le caratteristiche del tessuto di partenza. La figura riportata sotto illustra i totali cumulativi degli allineamenti unici e ad alta qualita' per uno dei due campioni

Abbiamo effettuato con successo il sequenziamento di 4 librerie 'mate paired' in collaborazione con un laboratorio di Ricerca dell’ EMBL di Monterotondo - Mouse Biology Unit. Per ciascuna delle librerie abbiamo ottenuto tra i 52 e i 64 milioni di biglie utilizzabili, ciascuna con 2 tag (vedi figura sottostante, sulla struttura della libreria). Ciascuna libreria è stata caricata su un quadrante del vetrino di sequenziamento del SOLiD. L’analisi bioinformatica di queste sequenze è condotta da un gruppo di ricerca all’European Bioinformatics Institute in collaborazione con l’EMBL di Monterotondo.

In collaborazione con L’IDI di Roma e con l’IRCCS Policlinico San Donato (Milano) abbiamo completato con successo il nostro primo sequenziamento di miRNA umani (Small RNA Expression Kit) ottimizzando le condizioni sperimentali in termini di rese finali e utilizzando differenti strategie analitiche in termini di sensibilità e specificità. Sino ad oggi, sul migliore dei campioni ottenuti abbiamo identificato, con criteri di analisi molto stringenti (mismatch massimo 1 nucleotide) 3.523.322 molecole di miRNAs noti ed un totale di 586 differenti specie molecolari presenti da 1 a 917.721 copie. L’analisi bioinformatica completa per l’identificazione e l’annotazione di nuovi miRNA, utilizzando strategie proprietarie ed in collaborazione con i Ricercatori coinvolti nel progetto è conclusa ed ha portato all'identificazione di diversi nuovi candidati miRNA.

La figura riportata sotto si riferisce al log in base 10 dell’abbondanza relativa [100* (conte / totale delle sequenze)] di miRNAs corrispondenti a due diverse librerie in due diverse condizioni.

Il grafico illustra la distribuzione dei trascritti in differenti classi riferite ad i livelli di espressione: pochissimo (-4 to -2), poco (-2 to -1), molto (-1 to 1), moltissimo (>= 1, corrispondente ad una percentuale relativa >= 10%). Sono visualizzati anche i miRNAs con un livello probabile di espressione differenziale tra le 2 librerie, e gli outliers.

Un team di bioinformatici provenienti da gruppi afferenti ad Università ed Istituti di Ricerca Italiani, coordinato da Genomnia, è stato invitato ed ha partecipato al RNAseq Genome Annotation Assessment Project (RGASP Competition) 2009 organizzato dal Sanger Institute. Unico gruppo italiano partecipante al progetto, si è concentrato sull’identificazione di non coding cRNA da dati di sequenziamento massivo.

In collaborazione con un Laboratorio di Ricerca del Dipartimento di Genetica Medica dell’Università di Losanna, Svizzera, abbiamo completato con successo il risequenziamento mirato di una regione di 31 kb, che includeva, in un introne, una zona con un numero variabile di ripetute tandem (VNTRs) all’interno di una delle quali in era presente una mutazione puntiforme. Abbiamo ottenuto > di 15.000.000 di reads di 50 basi, mappate con un minimo di 49 identità si questa regione. Di queste il 54% senza alcun color mismatch; il 25% con un color mismatch; l’11% con 2 mismatch; il rimanente 10% con > 3 color mismatch. Un solo mismatch in codice colore corrisponde ad un errore nella sequenza, ma mismatch multipli possono corrispondere ad un polimorfismo, posto che seguano combinazioni di colori specifiche. La mutazione (in eterozigosi) è stata chiamata correttamente.

La figura sottostante riassume la copertura delle reads lungo la regione risequenziata. Sull’asse delle X è riportata la coordinata del punto medio di ciascuna sequenza in nucleotidi; sull’asse delle Y la frequenza (cioe' il numero di reads che coprono quella regione).